摘要 ?合成材料組織工程骨移植物是當(dāng)前骨移植材料研發(fā)重點(diǎn)，發(fā)展迅速，但是，目前研發(fā)的各類支架材料性能存在缺陷，還不能完全滿足臨床要求；細(xì)胞體外篩選、擴(kuò)增、分化和為能在局部持續(xù)釋放細(xì)胞因子而采用的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植或腺病毒轉(zhuǎn)染局部細(xì)胞等技術(shù)還存在安全隱患，回植體內(nèi)后不能保證細(xì)胞活性，細(xì)胞骨組織工程種植體構(gòu)建質(zhì)量、及時(shí)性，儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)确矫孢€不具臨床規(guī)模化應(yīng)用的可行性。目前，無細(xì)胞人工合成材料在臨床上脊柱融合、良性骨腫瘤刮除后填充等方面應(yīng)用較普遍，細(xì)胞骨組織工程移植物應(yīng)用僅見于散在病例報(bào)道。

關(guān)鍵詞 ?骨組織工程；支架；干細(xì)胞；細(xì)胞因子；

臨床上嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除、骨感染、骨壞死等原因?qū)е碌牡墓侨睋p、骨折不愈合以及人工假體置換及翻修、脊柱、關(guān)節(jié)融合等十分常見，自體皮質(zhì)-松質(zhì)骨移植仍是無法被替代的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是，存在諸如供區(qū)新的創(chuàng)傷、感染、疼痛等并發(fā)癥，特別是，來源有限不能滿足臨床需要，因此，同種異體骨以較好的骨傳導(dǎo)、誘導(dǎo)性，成為繼自體骨移植之后的首選[1]，但是，來源仍然有限，其他缺陷如：新鮮異體移植存在疾病傳播、免疫排斥和難以保存等問題；深低溫或凍干處理可降低免疫原性和疾病傳染，但成骨誘導(dǎo)性能降低；異體脫鈣骨（demineralized bone matrix ，DBM)的骨誘導(dǎo)性也較差，并受加工方法和供體年齡等因素的影響等。在自體和異體骨越來越不能滿足臨床需要的的情況下，組織工程化骨人工合成材料的研發(fā)與應(yīng)用成為重點(diǎn)。

1. 組織工程化骨修復(fù)材料的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀 ?器官的組織工程的一般技術(shù)路線是在體外用支架、種子細(xì)胞、細(xì)胞活性因子有機(jī)結(jié)合，構(gòu)建有生命的種植體，植入缺損部位，以替代病損組織器官，恢復(fù)正常的生理結(jié)構(gòu)和功能。骨組織結(jié)構(gòu)、生化代謝和生理功能相對(duì)較簡單，與軟骨、肌腱、神經(jīng)等組織工程再造相比，骨組織工程又具有一定的特殊性，其種植體的構(gòu)建除經(jīng)典的支架+細(xì)胞+細(xì)胞活性因子模式外，還有支架+細(xì)胞和支架+細(xì)胞活性因子等。從1965年Urist發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)（Bone Morphogenetic Protein,BMP），40年來研究者著力構(gòu)建了承載BMP的緩釋系統(tǒng)（Drug Delivery ? 作者單位： 200025 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院瑞金醫(yī)院骨科上海市傷骨科研究所 ?基金項(xiàng)目： ? 上海市“登山計(jì)劃”，No.06DZ220202 System,DDS），這種支架+細(xì)胞活性因子植入體內(nèi)后，局部持續(xù)釋放BMP，作用于隨血管和肉芽長入的基質(zhì)干細(xì)胞和血液中骨髓干細(xì)胞，誘導(dǎo)成骨促進(jìn)骨修復(fù)。學(xué)者將這種無細(xì)胞種植體歸為廣義組織工程骨范疇，而且后者省掉了細(xì)胞分離培養(yǎng)、復(fù)合等復(fù)雜環(huán)節(jié)，不涉及細(xì)胞移植的倫理學(xué)問題，生產(chǎn)、保存、運(yùn)輸方便，更貼近臨床規(guī)模化應(yīng)用，成為骨組織工程的重要補(bǔ)充。 ? ? ? 無細(xì)胞人工材料普遍用于良性骨瘤刮除后填充和脊柱融合等 [2、3] ；細(xì)胞型組織工程骨 在2001年后陸續(xù)應(yīng)用于臨床。Vacanti用羥基磷灰石支架（hydroxyapatite scaffolds，HAS）復(fù)合經(jīng)過體外擴(kuò)增的骨膜細(xì)胞后，立即植入體內(nèi)修復(fù)再造外傷性缺失的拇指遠(yuǎn)節(jié)指骨[4]，證明了此方法臨床有效性；Quarto等[5]體外培養(yǎng)擴(kuò)增自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)，與HAS復(fù)合構(gòu)建細(xì)胞+支架移植物，立刻植入4-8cm骨干缺損處，證明對(duì)大骨缺修復(fù)有促進(jìn)作用，7年隨訪效果滿意；柴崗等[6]等用自體BMSCs復(fù)合DBM修復(fù)頜面部骨缺損成功；楊志明等[7]用異體骨膜復(fù)合支架修復(fù)多部位骨缺損、骨不連取得良好效果；Warnke等[8、9]利用鈦合金網(wǎng)填充牛骨松質(zhì)顆粒，復(fù)合自體BMSCs、BMP-7和Ⅰ型膠原（collagen type-Ⅰ）后立刻植入背闊肌袋中使血管化，7W后二次移植到下頜骨缺損處，成功再造下頜骨；Kitoh等[10]報(bào)道在用牽張成骨方法來治療2例軟骨發(fā)育不良、1例先天性脛骨假關(guān)節(jié)遺留下肢不等長（3個(gè)股骨、2個(gè)脛骨）時(shí)，在局部注射經(jīng)體外擴(kuò)增和誘導(dǎo)向成骨樣細(xì)胞分化的自體BMSCs、混入凝血酶（thrombin）、鈣離子(calcium)的富含血小板的血漿（platelet-rich plasma ，PRP) ，可加快成骨并安全微創(chuàng)；Morishita等[11]將自體BMSCs體外擴(kuò)增、成骨誘導(dǎo)，在2-4d分化為成纖維細(xì)胞是與HA復(fù)合，經(jīng)過4W增殖分化，通過檢測證明成骨構(gòu)建了體外再生骨，并用于3例良性骨腫瘤治療，術(shù)后影像學(xué)結(jié)果顯示，骨修復(fù)速度比文獻(xiàn)報(bào)道的單純HA明顯加快。.此外，組織工程技術(shù)在口腔頜面外科重建腭骨[12]牙周組織[7] 牙槽骨裂成型 [13] ，以及上頜竇底加強(qiáng) [14] 、牙槽骨脊重建 [15] 等都有報(bào)道。迄今， 臨床應(yīng)用只是一些零星報(bào)道和初步觀測，對(duì)該技術(shù)臨床全面評(píng)價(jià)尚缺乏足夠的資料[16]

2． 規(guī)模化臨床應(yīng)用面臨的主要問題和對(duì)策 ?

2.1 ?目前制約骨組織工程臨床規(guī)模化應(yīng)用的是基礎(chǔ)研究的各個(gè)環(huán)節(jié)存在的技術(shù)瓶頸。 ? ? 首先，目前開發(fā)的單一支架材料各有優(yōu)缺點(diǎn)，如天然膠原和纖維蛋白凝膠組織相容性較好，但機(jī)械性能差；可降解是聚乳酸等人工材料優(yōu)點(diǎn)，但親水性及組織相容性差；以磷酸為基礎(chǔ)的骨水泥、陶瓷或生物活性玻璃等材料的生物相容性及骨傳導(dǎo)性較好，但力學(xué)性能差、易碎裂而不能滿足臨床要求。復(fù)合材料性能一定程度上可產(chǎn)生優(yōu)勢互補(bǔ)，但距臨床要求存在差距。目前臨床應(yīng)用的主要是羥基磷灰石。其次，細(xì)胞選擇、培養(yǎng)等環(huán)節(jié)存在安全隱患。自體BMSCs的應(yīng)用最貼近臨床，但干細(xì)胞在骨髓中含量極低（0..003—0.015%） [17] ,必須先獲 取并在體外擴(kuò)增，然而，研究表明最大24-40次倍增就會(huì)進(jìn)入老化或生長停滯期，從而限制了臨床應(yīng)用[18]。基因工程方法異位表達(dá)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶，可以消除因多次細(xì)胞分裂引起染色體端粒的縮短，細(xì)胞可無限分裂，從而無限延長細(xì)胞壽命 [19] ，但出于安全考慮只限于實(shí) 驗(yàn)室。干細(xì)胞從體內(nèi)到體外，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)行為變異與轉(zhuǎn)型[20]，體外擴(kuò)增細(xì)胞輸入體內(nèi)后也會(huì)異常生長 [21] ，一項(xiàng)研究顯示鼠類的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過體外長期培養(yǎng)后導(dǎo)致染色體積累 損傷，最后出現(xiàn)惡變[22]；細(xì)胞體外培養(yǎng)常規(guī)在培養(yǎng)液中加胎牛血清，不可避免會(huì)傳染疾病如瘋牛病[23]或由異體蛋白觸發(fā)免疫反應(yīng)[24]。此外，也有研究者立足自體成體細(xì)胞，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將4種基因[25]OCT4、NANOG、SOX2、LIN28或OCT3/4、SOX2、C-MYC和KLF4 [26] 轉(zhuǎn)入到人的體細(xì)胞中，得到類似于胚胎干細(xì)胞的多能干細(xì)胞，增強(qiáng)增殖分化能力， 滿足治療需要，但潛在致瘤風(fēng)險(xiǎn)只限于實(shí)驗(yàn)室。自體來源的種子細(xì)胞不能用來儲(chǔ)備建細(xì)胞庫，急需時(shí)方可著手準(zhǔn)備，體外擴(kuò)增時(shí)間長，患者不得不長時(shí)間等待。同種異體細(xì)胞可作為細(xì)胞庫種子細(xì)胞預(yù)先儲(chǔ)備，但是，除了遇到與自體細(xì)胞相同培養(yǎng)問題外，涉及更為復(fù)雜的免疫原性問題。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用[27]，包括促進(jìn)I型輔助T細(xì)胞向Ⅱ型轉(zhuǎn)變、下調(diào)NK細(xì)胞釋放干擾素--γ(IFN-γ)、和B細(xì)胞合成抗體，并且，為避免牛血清培養(yǎng)帶來風(fēng)險(xiǎn)，用人冰凍血漿 [28] 或血小板裂解液 [29] 代替牛血清，發(fā)現(xiàn)不僅可提高增值率，而且不改變 形態(tài)學(xué)、免疫表型和分化能力,也沒有基因異常[30、31]、并且保持了免疫修飾，抑制異體蛋白導(dǎo)致淋巴細(xì)胞增殖[32]，對(duì)裸鼠不具致瘤性[33]，這為用異體基質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞建庫提供支持；另外，研究發(fā)現(xiàn)CTLA4-Ig（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4-Ig）是一種融合免疫球蛋白，可以選擇性地阻斷CD28與B7的信號(hào)傳導(dǎo)通路，阻斷T細(xì)胞殺傷作用和產(chǎn)生免疫耐受。將CTLA4-Ig基因轉(zhuǎn)到異體MSCs，改變移植細(xì)胞的性狀，逃避或阻止宿主識(shí)別，降低異體細(xì)胞免疫原性，以此構(gòu)建組織工程骨成功實(shí)現(xiàn)了異位成骨 [34] ；除了干細(xì)胞 外，有研究證明胎兒骨細(xì)胞在免疫原性和成骨性能上優(yōu)于骨髓干細(xì)胞[35]，少量來源就可滿足種子細(xì)胞建庫需要；以上發(fā)現(xiàn)有待于長期觀測論證。第三，目前構(gòu)建的緩釋系統(tǒng)對(duì)成骨因子緩釋不能完全模擬體內(nèi)過程。常用的一些基因技術(shù)手段如轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植或腺病毒轉(zhuǎn)染局部細(xì)胞在局部生產(chǎn)細(xì)胞因子，有導(dǎo)致免疫反應(yīng)、傳染疾病、細(xì)胞惡變之嫌[22、23、24、35]。 。第四，種植體在體內(nèi)外構(gòu)建過程中細(xì)胞生存狀態(tài)不確定，因?yàn)椋?xì)胞生存要求穩(wěn)定外環(huán)境，包括溫度、PH值和營養(yǎng)和氧氣供應(yīng) [37] ，體內(nèi)細(xì)胞和毛細(xì)血管距離20-200μm，細(xì)胞通過彌散 獲取營養(yǎng)和氧氣[38]，在體外，100-200μm距離也可實(shí)現(xiàn)[39],細(xì)胞在體外三維結(jié)構(gòu)中，營養(yǎng)和氧氣獲取困難，復(fù)合細(xì)胞的結(jié)構(gòu)質(zhì)量逐漸下降[40、41、42、43]；在靜態(tài)培養(yǎng)條件下發(fā)現(xiàn)三維支架